《威士忌生产工艺与营销策略（第二版）》第八章

第8章：污染：威士忌发酵中的细菌和野生酵母

Nicholas Wilson

摘要

  由于蒸馏厂发酵前缺乏煮沸阶段，微生物污染十分常见。这些微生物主要包括乳酸菌（LAB）和野生酵母，其他潜在微生物如醋酸菌和肠道细菌的污染程度较低。污染微生物通过与蒸馏酵母竞争营养物质以及产生有毒代谢产物（尤其是有机酸）影响发酵性能。高水平污染（尤其是发酵初期）会导致烈酒产量下降和异味形成。然而，初始酵母发酵结束后的二次乳酸菌发酵不会降低烈酒产量，且普遍认为其能赋予许多积极的风味特征。这种二次发酵被称为“后期乳酸”发酵，可为最终烈酒带来宜人的甜味、果味和黄油味。

关键词

细菌 同系物 污染 乳酸 乳酸菌（LAB 内酯 后期乳酸发酵 异味 耐热性 野生酵母

  在威士忌生产中，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）利用可发酵碳水化合物产生乙醇、二氧化碳和其他代谢物，其中许多物质对威士忌风味有贡献。然而，与啤酒酿造不同，麦芽汁不经过煮沸，且在许多国家使用抗生素等抗菌剂处理威士忌发酵属于非法行为，因此各种微生物污染不可避免。本章探讨污染微生物的多样性，特别是感染威士忌生产的乳酸菌和野生酵母，及其对发酵性能和烈酒特性的影响。

  蒸馏厂发酵缺乏煮沸阶段使微生物污染不可避免（表8.1）。主要污染途径如下：谷物供应中含有耐热微生物，如乳酸菌、野生酵母和醋酸菌，这些微生物能在糖化温度下存活；木质发酵槽（washbacks）为先前发酵中存在的任何微生物提供了庇护所，使其污染后续发酵，因为这些容器几乎无法灭菌（Dolan，1976）；用于清洁的污染工艺水和酵母供应本身可能含有极低水平的野生酵母和乳酸菌。麦芽汁对污染微生物施加的渗透压应激具有一定抗菌活性，但直到发酵进行时，所形成环境的恶劣性才开始对除最具适应性和耐受性之外的微生物构成威胁。作为麦芽微生物群一部分的醋酸菌（如Acetobacter属）和需氧酵母相对不受糖化阶段影响，但在厌氧条件加剧时无法存活；可能通过污染工艺水引入的肠杆菌无法耐受蒸馏厂发酵中因产酸导致的pH下降。

污染物 来源 过程位置 造成的问题
乳酸菌 麦芽、谷物粉尘、酵母供应 贯穿始终，尤其在发酵后期 产量降低、产酸和双乙酰、异味
醋酸菌 植物材料、工艺水 麦芽汁、发酵初期、酵母供应 酸性异味
肠杆菌 植物材料、工艺水 麦芽汁、发酵初期、酵母供应 产硫化物和双乙酰、异味
野生酵母 麦芽、谷物粉尘、酵母供应 发酵酵母贯穿始终，需氧酵母仅在初期 产量降低、产杂醇油和双乙酰、异味

表8.1 酒厂发酵的潜在污染物

  啤酒厂在发酵间重复接种酵母的做法在蒸馏行业并不常见，因此啤酒厂发酵中常见的肠道污染物Obesumbacterium属污染通常不被视为问题。此外，蒸馏厂发酵的强酸性pH值阻止了此类生物的繁殖。现代蒸馏厂的主要酵母供应通常具有高卫生质量，污染物数量足够少，通常无关紧要。然而，如果将酿造酵母作为二次酵母接种（例如来自啤酒厂的艾尔酵母），则引入了另一种潜在污染途径。使用艾尔酵母可能引入Zymomonas细菌，其在啤酒中导致腐蛋和果味异味（Van Vuuren和Priest，2003），因此会对任何生成的烈酒产生负面影响。如果使用二次酿造酵母，还可能引入Pediococcus属细菌，这些细菌已知通过产酸和双乙酰使啤酒产生所谓的“sarcina sickness”，并能产生细胞外黏液导致感染发酵的“黏性”（Van Vuuren和Priest，2003），从而导致烈酒异味并损害发酵稳定性。尽管Zymomonas和Pediococcus在使用二次酵母的蒸馏厂发酵中均有可能成为严重污染物，但酒精的存在、可用营养物质的缺乏以及此类发酵的低pH值通常足以限制感染的影响。

  此时麦芽蒸馏厂和谷物蒸馏厂的污染影响存在差异。麦芽蒸馏厂使用100%麦芽和木质发酵槽，似乎比使用压力煮熟的小麦或玉米作为90%可发酵底物的大型工业规模谷物蒸馏厂更容易受到污染。麦芽含量降低和不锈钢发酵槽的使用似乎使谷物蒸馏厂对微生物感染更具弹性。然而，此类操作的大规模工业性质提供了替代污染途径，使问题进一步复杂化。工艺水回收、换热器和管道堵塞以及更大、更多的发酵槽等问题都可能显著增加谷物蒸馏厂的污染潜力。

  威士忌发酵的酸性、厌氧、含乙醇和营养匮乏的环境导致优势微生物仅限于接种的酿酒酵母，污染物主要由乳酸菌代表，其为麦芽微生物群的一部分，并在不同程度上耐受上述条件（Van Beek和Priest，2000）。蒸馏厂中存在的乳酸菌菌株和物种范围通常稳定，但受麦芽供应和蒸馏厂卫生实践波动的影响（Simpson等人，2001）。

  乳酸菌根据其碳水化合物代谢细节（特别是该代谢的代谢产物）进行分类。专性同型发酵乳酸菌（包括Lactococcus、Pediococcus、Streptococcus和某些Lactobacillus物种）使用糖酵解产生乳酸作为唯一终产物（图8.1）；专性异型发酵乳酸菌（如Leuconostoc和某些Lactobacillus物种）使用6-磷酸葡萄糖酸/磷酸酮醇酶（6-PG/PK）途径代谢碳水化合物，产生乳酸、二氧化碳和乙醇或乙酸（图8.2）；兼性异型发酵菌（主要由各种Lactobacillus物种组成）能够根据环境条件利用糖酵解途径和6-PG/PK途径（Axelsson，2004）。由于乳酸菌在威士忌发酵中与酵母竞争碳水化合物，其存在和类型对威士忌行业至关重要。

图8.1 同型乳酸发酵

图8.2 异型乳酸发酵

  威士忌发酵中乳酸菌种群的演变可分为三个阶段（图8.3）。起初细菌多样性高，随发酵进行而下降（Van Beek和Priest，2003）。在发酵初始阶段（0至30-40小时），细菌生长受酵母快速生长和乙醇积累的抑制（Thomas等人，2001；Van Beek和Priest，2002）。此阶段细菌菌群主要由异型发酵乳酸菌组成，如Leuconostoc、Saccharococcus和Streptococcus，以及Lactobacillus brevis和Lactobacillus fermentum（Van Beek和Priest，2002）和在糖化醪中观察到的Bacillus coagulans（Cachat，2005）。Leuconostoc属对高浓度乙醇耐受性较低，因此在发酵初始阶段后不久就不再存在。在发酵第二阶段（30-40至70小时），酵母种群进入稳定期并开始下降，此时乙醇生产完成80-90%。随着酵母种群死亡，L. fermentum、L. paracasei和L. ferintoshensis等乳杆菌增殖，导致乳酸和乙酸积累，加速酵母衰退，最终使乳杆菌占据优势（Van Beek和Priest，2002）。在最后阶段（70小时以后），主要由L. acidophilus、L. delbrueckii和L. paracasei等同型发酵菌组成的细菌种群达到峰值后下降。由于此阶段缺乏可发酵糖，这些细菌被认为依靠从死亡和自溶的酵母细胞中释放的营养物质存活。

图8.3 发酵过程中乳酸菌种群的演变和生长

  威士忌发酵中乳酸菌的存在可被视为既有不利也有有利影响，取决于污染程度和污染管理方式。已知高初始乳酸菌水平（>10⁶ cells mL⁻¹）会降低乙醇产量，导致收入损失（Makanjoula等人，1992）。此外，发酵开始时大量细菌种群的存在可导致负面风味特征的产生（Van Beek和Priest，2002）。乳酸菌抑制酵母乙醇生产的主要方式是产生乳酸，在较小程度上产生乙酸。乳酸生产将可发酵底物从酒精生产中转移，因为乳酸菌使用的每个糖分子会导致损失两个乙醇分子。其次，乳酸积累降低pH值，若存在乙酸，其影响会加剧（Narendranath等人，2001）。此外，蒸馏厂发酵中乳酸菌的脂肪酸生产可能对酵母代谢产生抑制作用，尤其是在发酵后期（Lowe和Arendt，2004）。

  低初始乳酸菌种群（10³至10⁵ cells mL⁻¹）将被酵母的广泛生长和乙醇积累抑制（Thomas等人，2001），直到酵母种群开始下降且乙醇生产停止。此时乳酸菌种群可能大量繁殖（图8.4）。这种二次发酵不干扰乙醇生产，并允许积累理想的风味和香气化合物（Van Beek和Priest，2002）。

图8.4 典型蒸馏厂发酵的微生物概况

  尽管乳酸菌在威士忌发酵中是主要微生物，但已观察到野生酵母的背景种群（Neri，2006）。蒸馏酿酒酵母菌株的优势使野生酵母种群保持在低水平（10¹至10⁴ cells mL⁻¹），且在发酵过程中似乎没有演变（Neri，2006）。污染野生酵母包括各种非蒸馏酿酒酵母菌株、Pichia membranifaciens、Candida属、Issatchenkia orientalis和Torulaspora delbrueckii。

  已观察到酿酒酵母野生菌株作为啤酒厂污染物，有限种群对发酵无明显不利影响。然而，它们与蒸馏酵母的生化相似性意味着不能忽视对糖的竞争和潜在异味的产生（Campbell，2003）。有趣的是，发酵后期出现的酿酒酵母变体可能代表蒸馏菌株的突变（例如呼吸缺陷酵母），这是长时间发酵（约50小时）中恶劣条件导致的结果。

  显著的Pichia membranifaciens污染会导致严重问题，因为其在高乙醇浓度下进行需氧代谢（Campbell和Msongo，1991）。此类酵母是常见的啤酒厂污染物（Campbell，2003），可能通过使用二次酵母引入蒸馏厂发酵。Issatchenkia orientalis是一种需氧酵母，已知会产生异味并在污染的啤酒发酵表面形成菌膜（ scum-like layer），是使用二次酵母的蒸馏厂的潜在污染物（Campbell，2003）。

  与酿酒酵母野生菌株一样，发酵酵母Torulaspora delbrueckii因其生化相似性与蒸馏酵母竞争营养物质。它是啤酒厂发酵中的常见污染物，但因其存在而观察到的有害影响很少。然而，数量足够高时，它可能导致异味发展（Campbell，2003）。有人认为，如果在后期乳酸发酵期间存在，这种背景种群可能有助于形成与甜味和奶油味相关的积极风味特征（Wilson，2008）。

  新酒中除乙醇外的主要同系物是高级醇、酯、醛、酮、有机酸、羰基化合物、酚和含硫化合物（Palmer，1997），以及脂肪酸和内酯（Wanikawa等人，2000）。已有大量文献记载，高水平乳酸菌污染可通过降低乙醇产量损害所得烈酒的感知质量（Makanjoula等人，1992）。然而，如果发酵管理得当，乳酸菌可在后期乳酸发酵期间促进积极风味特征，主要由于酯产量增加（Campbell，2003）。较少为人知的是此类污染的存在如何影响同系物数量，以及此类差异如何反映在烈酒质量中。

  新酒中最丰富的同系物是高级醇，主要是丙醇、异丁醇、戊醇和异戊醇。与乙醇产量一样，早期乳酸菌污染会降低高级醇浓度；由于高级醇被认为在威士忌中赋予积极的绿色/草香，因此可以推断高级醇浓度降低将导致绿色/草香减少。威士忌中绿色/草香的发展还受野生酵母存在的影响，野生酵母产生高级醇和醛（Wanikawa等人，2002）。尽管现有数据显示野生酵母污染与绿色/草香发展之间几乎没有相关性（Neri，2006），但有证据表明野生酵母污染（Torulaspora delbrueckii）与后期乳酸发酵（尤其是在Lactobacillus paracasei和L. plantarum存在下）结合时，与绿色/草香呈正相关，伴随乙醛、丙醇和异丁醇浓度升高（Wilson，2008）。可能其他污染物衍生化合物也有助于绿色/草香发展，包括庚醇、辛醇、壬醇和各种顺式和反式壬烯醛异构体（Wanikawa等人，2002）。

  已知后期乳酸发酵在威士忌中赋予果味和酯香，这归因于乳酸积累和随后乳酸乙酯浓度增加（Van Beek和Priest，2002）。污染的同型发酵乳酸菌比异型发酵菌产生更多乳酸。与使用专性异型发酵菌的乳酸发酵相比，使用专性同型发酵菌或兼性异型发酵菌的后期乳酸发酵将导致烈酒中乳酸乙酯浓度增加（Wilson，2008）。在实验室规模下，乳酸乙酯以及乙酸乙酯、己酸乙酯和辛酸乙酯对果味和酯香发展的影响尚无定论（Wilson，2008）。后期乳酸发酵的感知感官益处可能归因于工业规模发酵和蒸馏阶段中多种酯和类似化合物的复杂相互作用。

  除了后期乳酸发酵对烈酒质量的一般积极影响外，具有低感官阈值的特定化合物的少量存在可产生重要的感官影响。内酯就是这样一组化合物。已知威士忌中存在的内酯包括β-甲基-γ-辛内酯（陈酿过程中来自木桶的衍生物）、来自麦芽的γ-壬内酯，以及发酵过程中产生的γ-癸内酯和γ-十二内酯，它们有助于产生宜人的甜味和黄油味（Wanikawa等人，2000）。乳酸菌（Lactobacillus brevis）和野生酵母（Torulaspora delbrueckii）污染影响这些强效风味化合物的积累，它们由酵母通过从头合成或羟基脂肪酸的生物转化形成（Wanikawa等人，2000）。在发酵后期，乳酸菌通过产生羟基脂肪酸（特别是10-羟基棕榈酸和10-羟基硬脂酸）拮抗酵母种群，然后酵母将其氧化分别产生γ-癸内酯和γ-十二内酯。如果存在T. delbrueckii，这些内酯的产量进一步增加（Wilson，2008）。L. brevis产生双乙酰（丁二酮）在T. delbrueckii存在下也会增加，这进一步复杂化了后期乳酸发酵赋予的甜/黄油香气的感知（Wilson，2008）。

参考文献

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